27 липня 1834 року Київський університет прийняв перших 62 студентів. Спочатку діяв лише один філософський факультет з двома відділеннями — історико-філологічним та фізико-математичним. 1835 року відкрився юридичний факультет, а 1847 року — медичний. Філософський згодом розділився на два самостійні факультети. З такою структурою університет працював до 1917 року.
До Жовтневої революції в університеті викладали відомі вчені: математики Б. В. Делоне, Д. О. Граве, М. А. і А. А. Дяченки, Б. Я. Букрєєв (з 1889 до 1962), фізики Й. Й. Косоногов, М. П. Авенаріус, астроном Р. Фоґель, зоологи О. О. Ковалевський, О. М. Сєверцов, О. О. Коротнєв, історики і філософи М. О. Максимович (перший ректор), М. І. Костомаров, М. В. Довнар-Запольський, В. С. Іконніков, М. П. Драгоманов, І. В. Лучинцький, Ю. А. Кулаковський, літератор М. П. Дашкевич, філолог В. М. Перетц, юристи О. Ф. Кістяківський, Г. І. Ейсман, економісти М. І. Зібер (один з перших пропагандистів марксизму в Росії), С. Й. Богородський, М. Х. Бунге, І. В. Вернадський (батько першого президента АН УРСР — НАНУ, академіка В. І. Вернадського), хіміки С. М. Реформатський, М. А. Бунге, механік Г. К. Суслов, геолог М. І. Андрусов, вчені-медики В. О. Бец, Н. А. Хржонщевський, М. В. Скліфосовський, Г. М. Мінх, В. В. Підвисоцький, Ю. К. Шимановський, В. К. Високович, В. О. Караваєв, В. П. Образцов, М. М. Волкович, архітектор В. І. Беретті та інші